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標(biāo)題: pcr可以擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒嗎 [打印本頁]

作者: 莼試生物技術(shù) 時(shí)間: 2025-2-26 09:07
標(biāo)題: pcr可以擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒嗎
是的，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）可以用于擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒，但需要注意一些細(xì)節(jié)。
環(huán)狀質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：環(huán)狀質(zhì)粒是閉環(huán)的DNA分子，通常沒有自由的3'末端，因此與線性DNA不同。為了在PCR中擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒，必須設(shè)計(jì)合適的引物。
PCR擴(kuò)增方法：
全基因組擴(kuò)增：如果想擴(kuò)增整個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒，可以使用環(huán)狀質(zhì)粒的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。
線性化處理：一些情況下，可以通過限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開，得到線性化的質(zhì)粒DNA，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這樣做可以避免環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響。
PCR條件優(yōu)化：環(huán)狀質(zhì)?？赡軐?duì)PCR的擴(kuò)增效率有一定影響，因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)會(huì)限制DNA的解旋，可能需要優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，比如提高變性溫度或者使用高保真酶。
總的來說，PCR是可以用來擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒的，但可能需要針對(duì)質(zhì)粒的特殊結(jié)構(gòu)調(diào)整一些實(shí)驗(yàn)條件。

作者: 這世界那么多人 時(shí)間: 2025-3-5 21:44
你的見解讓我對(duì)這個(gè)問題有了新的認(rèn)識(shí)。

作者: 九和配件廠 時(shí)間: 2025-3-7 14:27

PCR可以擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒，但需要注意的是，PCR擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒的過程與擴(kuò)增線性DNA有所不同，且擴(kuò)增后的產(chǎn)物需要經(jīng)過進(jìn)一步處理才能形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。以下是對(duì)這一問題的詳細(xì)解答：

一、PCR擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒的原理

環(huán)狀質(zhì)粒PCR構(gòu)建定點(diǎn)突變序列的基本原理是限制性內(nèi)切酶Dpn I特異性切割雙鏈DNA中甲基化序列Gm6ATC。從大腸桿菌中分離的質(zhì)粒已在體內(nèi)的內(nèi)源性Dam甲基化酶作用下被完全甲基化了，因而對(duì)Dpn I的切割敏感，半甲基化的DNA被Dpn I切割的效率較低。相反，用四種通用脫氧核糖核苷酸體外合成的DNA沒有甲基化，因而完全抵抗切割。在定點(diǎn)突變后，能用Dpn I降解剩余的甲基化了的野生型模板，從而富集體外合成的未甲基化DNA。

二、PCR擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒的步驟

質(zhì)粒DNA變性：將質(zhì)粒DNA溶于水中，加入NaOH和EDTA溶液，在37℃下孵育以變性質(zhì)粒DNA模板。
DNA沉淀與收集：通過加入NaAc中和反應(yīng)液，并用預(yù)冷的乙醇沉淀DNA。離心收集變性的質(zhì)粒DNA，并清洗沉淀后重新溶于水中。
PCR擴(kuò)增：以變性的質(zhì)粒DNA為模板，使用兩條寡苷酸和高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過多輪熱循環(huán)后，全長(zhǎng)雙鏈質(zhì)粒DNA以線性形式擴(kuò)增，產(chǎn)生一種DNA雙鏈上帶缺口的突變質(zhì)粒。
瓊脂糖凝膠電泳檢查：擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查靶DNA的擴(kuò)增情況。
DNA純化：用苯酚-氯仿抽提擴(kuò)增產(chǎn)物兩次，乙醇沉淀收集DNA。
DNA磷酸化：將DNA重新溶于噬菌體T4多核苷酸激酶緩沖液中，加入噬菌體T4多核苷酸激酶和ATP進(jìn)行磷酸化反應(yīng)。
連接反應(yīng)：使用噬菌體T4 DNA連接酶將磷酸化的DNA進(jìn)行連接反應(yīng)，形成環(huán)狀閉合質(zhì)粒。
Dpn I消化：加入Dpn I緩沖液和Dpn I限制性內(nèi)切酶，混勻后在37℃下孵育以消化剩余的甲基化模板DNA。
轉(zhuǎn)化與篩選：將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選突變體并通過序列分析進(jìn)行確證。

三、注意事項(xiàng)

保真度高的酶：對(duì)于較大的質(zhì)粒，建議使用保真度高的DNA聚合酶以減少錯(cuò)誤率。
循環(huán)次數(shù)：環(huán)狀質(zhì)粒PCR線性擴(kuò)增應(yīng)保持在較少循環(huán)次數(shù)，以滿足條件必須使用相對(duì)大量的模板DNA。
Dpn I酶的消化過程：如果擴(kuò)增反應(yīng)正常但突變體產(chǎn)量低，應(yīng)懷疑Dpn I酶的消化過程，必要時(shí)可調(diào)整Dpn I的用量和消化時(shí)間。
質(zhì)粒的修復(fù)與提取：擴(kuò)增后形成的帶缺口的環(huán)狀質(zhì)粒需要轉(zhuǎn)化到宿主中，由宿主細(xì)胞內(nèi)的酶自動(dòng)修復(fù)缺口并形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。之后可以從宿主細(xì)胞中提取質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的分析和應(yīng)用。

作者: 晚點(diǎn)下班 時(shí)間: 2025-10-28 10:59
謝謝樓主無私奉獻(xiàn)，讓我們受益頗多。

作者: 沒有出息的小蟲 時(shí)間: 2025-12-1 08:37
你的問題很有普遍性，很多人都會(huì)遇到。

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